子のう菌の交配型遺伝子と病原性進化に関する考察
有江 力*・川部眞登*・金子 功**,1・吉田隆延***・加藤ハナ*・
山口 勇**・寺岡 徹*
Tsutomu ARIE*, Masato KAWABE*, Isao KANEKO**,1, Takanobu YOSHIDA***, Hana KATO*, Isamu YAMAGUCHI**, Tohru TERAOKA*:
Structural
and Functional Analysis of Mating Type (MAT) Genes in Ascomycetes
in the Relationship with Pathogenesis Evolution
Abstract
A polymerase chain reaction (PCR)- based
strategy to clone mating type genes from ascomycetes was established. The approach was efficient for cloning
mating type (MAT)
loci from heterothallic (sexual) ascomycetes.
Using the same strategy, we have also demonstrated that two asexual
phytopathogenic ascomycetes, Fusarium oxysporum (a pyrenomycete) and Alternaria alternata (a loculoascomycete) also
carry a MAT
locus which has only a few structural differences compared to that of their
heterothallic relatives. MAT genes in F. oxysporum and A. alternata were
expressed, and A. alternata MAT
genes were functional in a heterothallic ascomycete, Cochliobolus
heterostrophus,
when assayed by heterologous expression.
We also propose a PCR-based method which is useful for determining the
mating type of field isolates. All of
the strains of F. oxysporum f. sp. lycopersici (pathogen causing tomato wilt), carried
MAT1-1 except the strain MN-60, obtained from Professor H.C. Kistler,
University of Minnesota, which should be from a different evolutional lineage,
suggesting that the fungus still has the potential ability to reproduce
sexually but no mating partner is present in the population at this moment.
Key
Words
Fusarium
oxysporum, Alternaria
alternata, Gibberella
fujikuroi,
heterologous expression, asexual
�氈@はじめに
一般に生物は有性生殖（sexual reproduction）における配偶子形成時に、染色体の乗換えにより遺伝子を組換え、新たな形質を獲得すると考えられている。組換えによる新形質次世代の出現は、環境が変化した場合に、種としての適応性向上の可能性を示唆している。子のう菌類（ascomycetes）を含む糸状菌においても有性生殖すなわち交配（crossing又はmating）が薬剤抵抗性や新レース出現等、新形質を獲得する「場」として機能すると考えられる。ところが、興味深いことに、重要植物病原糸状菌の中には交配しない（あるいは交配が未だに観察されていない）いわゆる不完全性（asexual）の菌がたくさん存在する。例えば、萎凋性導管病を引き起こすFusarium oxysporum、ナシ黒斑病等を引き起こすAlternaria alternata、カンキツ類緑かび病菌Penicillium digitatum等を挙げることができる。さらに、我が国の最重要植物病原菌とも言われるイネいもち病菌Magnaporthe grisea（不完全世代：Pyricularia grisea）でも、これまでに我が国で分離された菌株は全てasexualである。以上を踏まえ、子のう菌の交配メカニズムあるいは交配能喪失のメカニズム解析を行うことが、植物病原菌における病原性・薬剤抵抗性進化の道筋を解明するためのヒントとなり、将来的に効率的な病害防除法の確立に結びつくことが期待される。
本稿では、菌株の交配型決定機能を持つと共に、交配初期の調節因子（master regulator）として機能すると考えられる子のう菌の交配型遺伝子（MAT）領域に関する情報を提供するとともに、MAT領域とasexualityとの関連についての研究の現状、さらには交配と病原性進化に関する考察について言及する。
� 子のう菌の生活環と完全世代
子のう菌類は有性生殖の結果、子のう胞子を形成するステージ、すなわち完全世代をその生活環の一部に持つ菌類によって構成されるグループである。その生活環を模式図で示すと図1の様になる。すなわち、生活環の多くの部分が分生子や厚膜胞子の形成・発芽、菌糸の伸長による、半数体（核相=単相（n））の無性生殖（asexual reproduction＝栄養繁殖）の繰返し（不完全世代imperfect stage）であり、その結果、親のクローンである子孫を生じる。一方、環境条件が整うと、交配を伴う有性生殖へ移行する（Nelson, 1996）。交配はまず、交配型の異なるペアの菌株間で細胞融合が起こり（n+n）、その後核融合により複相（2n）となる。核融合とそれに続いて起こる減数分裂の過程で遺伝子を組換え、新たな世代である子のう胞子を形成する過程を有性生殖あるいは交配と呼ぶ。子のう胞子は子のう殻等の子実体中に形成され、これを完全世代perfect stageと呼ぶ。基本的に、子のう菌の交配には後述のように交配型遺伝子座によって決定される交配型が異なるパートナー株の存在が必要である。
子のう菌は基本的に雌雄同株性であり、異なる交配型の菌株との出会いにより、交配が開始され、それぞれが雄および同時に雌として機能し、完全世代の形成につながる。たとえば、トウモロコシごま葉枯病菌Cochliobolus heterostrophusについて、以下の観察例がある。C. heterostrophusの交配型MAT1-1野生株と、MAT1-2アルビノ（色素生産能欠損）株を、滅菌したトウモロコシ葉をはさんでMM培地上に対峙すると、野生株側の葉上に黒色の偽子のう殻が、アルビノ株寄りの葉上に白色の偽子のう殻が形成され、どちらの子のう殻も内部に成熟子のうと、その中に次世代である８つの子のう胞子を形成する。一方、両菌株とも単独培養、あるいは同じ交配型の菌株同士（MAT1-1同士、あるいはMAT1-2同士）を同一条件で対峙培養しても完全世代の形成は見られない。これらの実験結果は、�@完全世代形成に異なる交配型のパートナーが必要であること、�AMAT1-1野生株が雌、MAT1-2アルビノ株が雄として機能して黒色の完全世代を形成し、逆に、MAT1-2アルビノ株が雌として、MAT1-1野生株が雄として機能することで白色の完全世代を形成したこと、言換えれば雌雄同株性であること、また、�B黒色および白色の子のう殻由来の子のう胞子から伸長した菌糸について色素生産能と交配型に関する四分子解析を行うと、どちらの場合でも、色素生産能を持つ野生型の株：アルビノ株＝１：１、交配型MAT1-1の株：MAT1-2の株＝１：１が独立に出現し、これは色素生産能および交配型が近接しないそれぞれ一つの遺伝子座によって決定されていることを示している。
�｡ 交配型遺伝子（MAT）
近年、分子生物学的な実験手法が急速に進歩した結果、Neurospora crassa、Podospora anserina、Cochliobolus heterostrophus等複数の子のう菌において、菌株の交配型を決定するそれぞれ１つの交配型遺伝子座（MAT1）が存在することが判明し、MAT1領域がクローニング・構造解析された（Glass et al., 1990; Staben and Yanofsky, 1990; Glass & Lorimer, 1991；Debuchy and Coppin, 1992；Turgeon et al, 1993；Coppin et al., 1997；Singh & Ashby, 1998；Arie, et al., 1999；Yun et al., 2000；足立・兼松 2001）。図２に、子のう菌門、pyrenomycetes綱、loculoascomycetes綱、discomycetes綱の代表的な種のMAT1領域の構造を模式的に示す。これまでにMAT1領域が解析されたすべての子のう菌（ホモタリックなものを除く；後述）において、MAT1領域は種内に二型（idiomorphs；MAT1-1およびMAT1-2）があり、菌株によっていずれかを持つ（図２）。その一方にはDNA結合部位であるhigh mobility group（HMG-box）モチーフを有するタンパク質（例えばC. heterostrophusではMAT1-2-1）が、他方には、同様にDNA結合部位であるa-boxと呼ばれるモチーフを持つタンパク質（C. heterostrophusではMAT1-1-1）がコードされており、両モチーフとも種を越え高いてアミノ酸配列の相同性を示した（Turgeon, 1998）。これらDNA結合部位を有するタンパク質は、自らのフェロモンプレカーサー遺伝子のプロモーター部位に結合してフェロモン産生を調節、完全世代の形成に繋がると考えられている（Zhang et al., 1998；Shen, et al., 1999）。
�｢ MAT1領域の構造に基づいた交配型・MAT1 idiomorph・MAT遺伝子の
統一的呼称
これまで、子のう菌菌株の交配型はテスター菌株との掛合わせによって決定されてきた。そのため、種ごとに独立した交配型およびMAT遺伝子の呼称が与えられていた（表１）。しかしながら、Turgeon & Yoder (2000)は、MAT1領域の遺伝子構造を基準にして、種を越えた統一的な呼称を与えることを提案している。すなわち、a-boxモチーフを持つタンパク質をコードしている遺伝子が存在するidiomorphをMAT1-1、そのidiomorph上に存在する遺伝子をMAT1-1-1等、そのidiomorphを持つ菌株の交配型をMAT1-1とすること、一方、HMG-boxモチーフが存在するidiomorphをMAT1-2、そのidiomorph上に存在する遺伝子をMAT1-2-1等、そのidiomorphを持つ菌株の交配型をMAT1-2とすることである。この基準に従った呼称を、従来の呼称と対比して表１に示した。なお、本稿においては、従来の呼称で記述する場合には、ゴチックフォントを使用することで区別した。
�｣ 子のう菌の交配様式とMAT遺伝子
子のう菌の交配様式は、上述したように、完全世代形成に異なる交配型のパートナーを必要とするヘテロタリック（heterothallic）が基本的ではあるが、交配パートナーを必要とせずに完全世代を形成するホモタリック（homothallic）な種あるいは菌株も数多く見出されている。ホモタリックな子のう菌菌株は、MAT1-1-1およびMAT1-2-1に相当するタンパク質をコードする遺伝子を併せ持つ、あるいは両タンパク質の融合タンパク質を産生していることが明らかにされている（Yun et al, 1999）。さらに、ホモタリックなCeratocystis spp.菌株は、MAT-1およびMAT-2遺伝子を併せ持つが、両者が存在するとMAT-2が優性に発現して交配型MAT-2となり、一方MAT-2遺伝子が抜け落ちることでMAT-1遺伝子が発現して交配型MAT-1となり、これらMAT-2とMAT-1の菌株とが交配することで完全世代を形成することが示されている（Witthuhn et al., 2000）。
一方、植物病原性子のう菌や産業に利用されている子のう菌には、交配しないあるいは交配が観察されていないasexualの株が多く見受けられる。これら、asexualな菌については、交雑実験が不可能であるために、交配型の検定や交配能の解析がこれまで不可能であった。ところが、ヘテロタリックな子のう菌においてMAT領域の遺伝子レベルでの解析が進み、DNA結合部位という種を超えた高い相同性を示すモチーフが見出されたこと（上述）を契機に、asexualな子のう菌の交配型の決定および交配能の解析が行えるようになった。すなわち、相同性の高い部位に設計したプライマーを用いたPCRベースの研究により、asexualな子のう菌（Alternaria alternata、Fusarium oxysporum等）からもMAT1領域が取得されたのである（Arie et al., 2000）。その結果、asexualな菌が近縁のヘテロタリックな菌とほぼ同様な構造のMAT1領域とidiomorphを持つこと（図２；表１）が明らかにされ、両idiomorph上の遺伝子にコードされているタンパク質の発現が確認された（Arie et al., 2000; Yun et al., 2000）。また、C. heterostrophusにおける他家発現によって、asexualなA. alternataの交配型遺伝子が機能することが明らかにされた（図３；Arie et al., 2000）。従って、現在ではasexualな子のう菌が交配しない理由として、�@交配型遺伝子の下流で機能するはずの遺伝子（群）の機能不全、�A交配群（交配し得る菌株の集団）中に交配パートナー（異なる交配型の株）が不在である、等が想定されている。
�､ 病原菌出現の進化学的考察と交配の関連
Leslie & Klein
(1996)は、統計遺伝学的見地から、遺伝子組換えの重要な「場」である交配の能力を失った菌は世代を重ねるにつれ淘汰されるはずであると考えた。しかしながら、植物病原子のう菌等にはasexualな株が多く存在している。彼らの数理解析によると「交配が次世代に不利になる場合」にだけ、asexualな菌がヘテロタリックな菌より優性になり得、寡占となることが可能になる。
ところで、筆者らは、asexualなF. oxysporumの多数の菌株について交配型を識別した結果、興味深い結果を得ている。リボゾームDNAのIGS領域等の塩基配列を元に、F. oxysporum菌株の分子系統樹を作成すると、トマト萎凋病菌F. oxysporum f. sp. lycopersiciには、進化学的に起源の異なる少なくとも二つのグループ（多分、異なる交配群mating populationを構成していると考えられている）が存在することが示されている。このうちの一方のグループに属する菌株は、米国フロリダ州やイタリアで少数の分離例があるに過ぎず、我が国で分離されたすべての菌株を含めて、その他世界各地より分離された菌株はもう一方のグループに属すると考えられる。これら菌株について交配型を識別したところ、前者のグループに属する菌株はすべてMAT1-2、後者に属する株はすべてMAT1-1であることが判明した（Arie et al., 2000）。以上の結果は、トマトに対する病原性を獲得した二つの祖先より独立にasexualな増殖を繰り返し、イタリアとフロリダに分布した群と世界的に分布した群の２群が現存することを示唆している。さらに著者の推測を重ねさせて戴ければ、「トマトに対する病原性を獲得した」ことは、「トマト」という有利な増殖の場を見いだしたことになり、他の菌株に対する優位性を保持していると考えられる。逆に言うと、トマトに病原性を持たない株と交配することは、次世代の一部の菌株が有利な増殖の場をみすみす失うことになり、「交配が次世代にとって不利になりうる」ため、asexualな増殖を繰り返すようになったのではないかと考えている。
�･ asexualな子のう菌は遺伝子組換えをしないのか？
これまでに得られている子のう菌のasexualityに関する研究成果を総合すると、asexualな子のう菌が交配能を示さない原因として、「交配可能なポピュレーション中には交配型が片方のみの菌株が存在する」ことが示唆される。では、asexualな子のう菌は、交配にとって代わる遺伝子組換えの「場」を持っているのであろうか？無性的な菌糸融合、二核共存体（heterokaryon）やその後起こる偽有性生殖（parasexual reproduction）がその「場」としての可能性を持つと考えられている。Sanders (1999)が雑誌Natureに『No sex please, we’re fungi』で投稿した様に、かびの多くは、完全世代の形成という複雑な過程をともなう有性生殖を省略してより簡便な偽有性生殖で遺伝子組換えを行うようになったのではないかとの推測もなされている。
�ｦ イネいもち病菌の交配型遺伝子
イネいもち病菌は、今後交配のメカニズムや交配と関連した病原性の進化の良い研究材料になるかもしれない。その理由は、�@イネいもち病菌は、 N. crassa以外では遺伝子レベルの情報が最も蓄積された子のう菌であること、とりわけゲノムプロジェクトの進展によって良い実験系となっている、�Aイネいもち病は、わが国における最重要病害で、長い歴史を持つわが国の植物病理学において未だ主要な研究対象であり、さらなる知見の集積が求められている、�Bわが国で分離されるイネいもち病菌菌株同士の交配は知られておらずいわばasexualであるにもかかわらず、中国等から分離される同種の中にはヘテロタリックな菌株が見出せることである。F. oxysporumやA. alternataでは、種内にはasexualな菌株しか見出せず、遺伝子の比較や他家発現を行う、さらには交雑を試みるのに支障となっているのに比べて大きな利点である、等を挙げることができる。
F. oxysporumやA. alternataで明らかになったのと同様に、M. griseaのasexual株のMAT1領域は、ヘテロタリックな菌株のものと構造的・機能的に同等であることが推測され、最初のステップとして、asexualな菌株とヘテロタリックな菌株のMAT1領域のシーケンスを決定し、比較することが必要になる。ところで、Kang et al. （1994）は、M. grisea（Mat1-1、 K76-79菌株；Mat1-2、WGG-FA40菌株）からMAT1領域をクローニングしたことを既に報告している。また、Xu et al.（1995）は、M. griseaのMAT領域の一部を増幅して交配型の検定を行うためのプライマー[1]を報告している。しかし、残念なことにM. griseaの交配型遺伝子領域全長の塩基配列、構造等の詳細情報については報告されていない。そこで、我々は現在、Xu et al.（1995）のプライマーで増幅される産物をもとに、TAIL-PCR法により、日本産のasexualな株（P2およびHoku-1）からMAT-1領域全長のクローニングを試みている。その過程で、P2のMAT1領域にはHMG-boxモチーフを持つタンパク質が、また、Hoku-1のMAT1領域にはa-boxモチーフを持つタンパク質がコードされていることを既に見出しており、Turgeon & Yoder（2000）が提案したMAT1イディオモルフの普遍構造を元にした交配型の識別法に従うと、従来のMat1-1→MAT1-2に、従来のMat1-2→MAT1-1と読みかえるのが妥当であると考えている（加藤ら、未報告）。さらに、MAT1-1イディオモルフの682 bpを増幅するB15＋B182プライマー、およびMAT1-2イディオモルフの371 bpを増幅するA1+A5プライマーの計４種類のプライマーを１チューブに加えて、multiplex-PCR反応を行うことで、１チューブ反応でM. grisea交配型の検定が行えることをも見出している（加藤ら、未報告）。
�ｧ 「交配研究」の展望
本稿で述べてきたMAT1領域上にコードされている遺伝子産物は、おそらく交配の開始時に機能するものと考えられる。子のう菌がしばしば見せるasexualityの原因として、当初は、asexualな株（または種）がMAT1領域を持たないか、その構造が不完全である、あるいはMAT遺伝子の不発現などを想定して研究を行ってきたが、現時点ではこれらの原因は否定されている。今後は、asexualityの原因として推定される�@MAT遺伝子の下流で機能する完全世代形成に関与する遺伝子の不全・不発現、および、�A交配できる集団中に交配パートナーが不在である、などの可能性についてさらに解析を進めたいと考えている。中でも、�Aは、植物病原菌の病原性進化や、寄主植物との共進化とも関連する興味深い研究テーマであり、さらにこれまでasexualであった株の交配パートナーを見出すキューピット役を果たせる可能性も期待される。
引用文献
足立嘉彦・兼松聡子 (2001). 果樹に寄生するDiaporthe属菌の交配型遺伝子領域の構造. 平成13年度日本植物病理学会大会講演要旨予稿集, 日本植物病理学会, 東京. pp.
31.
Arie, T., Christiansen, S. K., Yoder, O. C. and
Turgeon, B. G. (1997). Efficient
cloning of ascomycete mating type genes by PCR amplification of the conserved MAT HMG. Fungal
Genet. Biol. 21:118-130.
Arie, T.,
Yoshida, T., Shimizu, T., Kawabe, M.,
Yoneyama, K., and Yamaguchi, I. (1999).
Assessment of Gibberella fujikuroi mating type by
PCR. Mycoscience 40: 311-314.
Arie, T., Kaneko, I., Yoshida, T., Noguchi, M.,
Nomura, Y. and Yamaguchi, I. (2000).
Mating-type genes from asexual phytopathogenic ascomycetes Fusarium
oxysporum
and Alternaria alternata. MPMI
13:1330-1339.
Coppin, E., Debuchy, R., Arnaise, S. and Picard,
M. (1997). Mating types and sexual
development in filamentous ascomycetes. Microbiol. Mol. Biol. Rev.
61:411-428.
Debuchy, R. and Coppin, E. (1992). The mating types of Podospora anserina: functional
analysis and sequence of fertilization domains. Mol. Gen. Genet. 233: 113-121.
Glass, N. L., Grotelueschen, J., and Metzenberg,
R. L. (1990). Neurospora crassa A mating-type
region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
4912-4916.
Glass, N. L. and Lorimer, I. A. J. (1991). Ascomycete mating types. in More gene
manipulations in fungi. Academic Press, NY. pp. 193-216.
Kang, S., Chumley, F. G. and Valent, B.
(1994). Isolation of the mating-type
genes of the phytopathogenic fungus Magnaporthe grisea using
genomic subtraction. Genetics 138:289-296.
Leslie, J. F. and Klein, K. K. (1996). Female fertility and mating type effects on
effective population size and evolution in filamentous fungi. Genetics
144:557-567.
Nelson, M. A. (1996). Mating systems in ascomycetes: a romp in the sac. TIG
12:69-74.
O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., and
Ploetz, R. C. (1998). Multiple
evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant
evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 95:2044-2049.
Sanders, I. R. (1999). No sex please, we’re fungi. Nature 399:737-739.
Shen, W.-C., Bobrowicz, P. and Ebbole, D. J.
(1999). Isolation of pheromone
precursor genes of Magnaporthe grisea. Fungal Genet. Biol.
27:253-263.
Staben, C. and Yanofsky, C. (1990). Neurospora crassa a mating-type
region. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:
4917-4921.
Turgeon, B. G., Bohlmann, H., Ciuffetti, L. M.,
Christiansen, S. K., Yang, G, Schafer, W., and Yoder, O. C. (1993). Cloning and analysis of the mating type
genes from Cochliobolus heterostrophus. Mol. Gen. Genet. 238
:270-284.
Turgeon, B. G. (1998). Appilcation of mating type gene technology to problems in fungal
biology. Annu. Rev. Phytopathol. 36:115-137.
Turgeon, B. G. and Yoder, O. C. (2000). Proposed nomenclature for mating type genes
of filamentous ascomycetes. Fungal genet. Biol. 31:1-5.
Witthuhn, R. C., Harrington, T. C., Wingfield,
B. D., Steimel, J. P. and Wingfield, M. J. (2000). Deletion of the MAT-2 mating-type gene during
uni-directional mating-type switching in Ceratocystis. Curr. Genet. 38:48-52.
Xu, J.-R., Hamer, J. E. (1995). Assessment of Magnaporthe grisea mating type
by spore PCR. Fungal Genet. Newslett. 42: 80.
Yun, S.-H., Berbee, M. L., Yoder, O. C. and
Turgeon, B. G. (1999). Evolution of the
fungal self-fertile reproductive life style from self-sterile ancestors. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 96:5592-5597.
Yun, S.-H., Arie, T., Kaneko, I., Yoder, O. C.
and Turgeon, B. G. (2000). Molecular
organization of mating type loci in heterothallic, homothallic, and asexual Gibberella/Fusarium species.
Fungal Genet. Biol. 31:7-20.
Zhang, L., Baasiri, R. A. and Van Alfen, N. K.
(1998). Viral repression of fungal
pheromone precursor gene expression. Mol. Cell. Biol. 18:953-959.